免疫學經典實驗方法之一：ELISA

    酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）是免疫學中的經典實驗。指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。

基本原理：

       將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

分類：雙抗體夾心法、間接法、競爭法

一、雙抗體夾心法

1、實驗原理

圖1. 雙抗體夾心法測抗原示意圖

2、試劑

待測樣品、包被緩沖液 （碳酸鹽緩沖液或者磷酸鹽緩沖液）、抗體（捕獲抗體、檢測抗體、酶標二抗）、洗滌緩沖液（含有0.05%Tween-20的PBS7.4）、封閉緩沖液（含有1%BSA蛋白的洗滌緩沖液）、TMB顯色液、終止液（2M H2SO4或2M HCl）

3、儀器、耗材

96孔板 、移液器、離心管、酶標儀等

4、實驗步驟

① 包被抗體：用包被緩沖液將捕獲抗體球蛋白稀釋至最適濃度（1～10 μg /ml），96孔板每孔加100 ul，4 ℃過夜，或37℃孵育2 h。

② 洗滌：移去包被液，拍干，用洗滌緩沖液洗3次，每次2 min。

③ 封閉：每孔加入>250ul的封閉緩沖液。37℃封閉2h后洗滌。

④ 每孔加入100ul用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的待測樣本，37℃孵育2 h后洗滌。

⑤ 每孔加入100ul用稀釋緩沖液稀釋的檢測抗體，37℃孵育2 h后洗滌。

⑥ 每孔加入100ul稀釋后的酶標二抗、37℃孵育1h。

⑦ 洗滌：移去包被液，拍干，用洗滌緩沖液洗5-7次，每次2 min。

⑧ 每孔加入100 ul TMB底物溶液，室溫作用10-15min。

⑨ 加終止液：每孔加50ul終止液進行終止。

⑩ 測定并記錄結果：用酶標儀測定OD值（450nm）。

二、間接法

1、實驗原理

圖2：間接法測抗體示意圖

2、實驗試劑

包被緩沖液 （碳酸鹽緩沖液或者磷酸鹽緩沖液）、酶標抗體、洗滌緩沖液（含有0.05% Tween-20的PBS7.4）、封閉緩沖液TMB顯色液、終止液（2M H2SO4或2M HCl）

3、儀器、耗材

96孔板 、移液器、離心管、酶標儀等

4、實驗步驟

① 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（5～20 μg/ml），每孔100ul加入96孔板中,4℃過夜或37℃孵育2 h。

② 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次2分鐘。

③ 加待測樣品：每孔加入稀釋后的待測樣品100ul，37℃孵育2h。

④ 洗滌：同②。

⑤ 加入酶標抗體：每孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶標抗體100ul 37℃作用1小時。

⑥ 洗滌：同②。

⑦ 每孔加入100ul TMB底物溶液，室溫作用10-15min。

⑧ 加終止劑：每孔加50ul終止液。

⑨ 測定并記錄結果：用酶標儀測定OD值（450nm）。

三、競爭法

1、實驗原理

圖3：間接競爭法測抗原示意圖

2、實驗試劑

包被緩沖液 （碳酸鹽緩沖液或者磷酸鹽緩沖液）、酶標抗體、洗滌緩沖液（含有0.05% Tween-20的PBS7.4）、封閉緩沖液TMB顯色液、終止液（2M H2SO4或2M HCl）

3、儀器、耗材

96孔板 、移液器、離心管、酶標儀等

4、實驗步驟

① 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（1～10 μg /ml），每凹孔加100ul，4℃過夜，或37℃孵育2h。

② 洗滌：移去包被液，每孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次2min。

③ 加待測樣品：加入待測樣品和抗原特異性抗體各50ul， 37℃作用2h。

④ 洗滌：同②。

⑤ 加酶標二抗：每孔加入稀釋后的酶標二抗100ul，37℃孵育1h。

⑥ 洗滌：同②。

⑦ 每孔加入100ul TMB底物溶液，室溫作用10-15min。

⑧ 加終止劑：每孔加50ul終止液。

⑨ 測定并記錄結果：用酶標儀測定OD值（450nm）。

特點：

該法相較其他方法而言，有幾大特點

1、靈敏性高

該測定法的靈敏度來自作為報告基團的酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ，產生可供觀察的顯色反應現象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。

2、特異性強

其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。